四環凍干機—生物制品和生物組織凍干技術（七）

5.3.2  大鼠皮膚吹干與凍干比較研究

10年后，西北大學的楊維也進行了大鼠皮膚的冷凍干燥實驗。他首先重點研究了濃度、孵育時間、孵育溫度對大鼠皮膚凍干保護劑海藻糖負載量的影響。實驗結果表明，大鼠皮膚對海藻糖的載入量的優化條件為：海藻糖濃度800mmo1/L,孵育溫度37℃，孵育時間為7h。之后，皮膚組織分別進行凍干和吹干。

(1)凍干  皮膚組織在37℃加載海藻糖，4℃加載DMSO，將負載了海藻糖和DMS0的皮膚塊放入凍存管內，凍存管放入程序凍存盒，置于-80℃冰箱冷凍。12h后將冷凍的皮膚組織連同凍存管轉入預冷的凍干機，去掉凍存管蓋子。冷凍干燥機運行狀態參數為：冷阱中溫度-45℃，冷阱上方溫度0℃左右，真空度10Pa,凍干時間設置30h。先將皮膚樣品置于冷阱中凍干24h，然后在冷阱上方凍干6h。先在冷阱中凍干是為了防止皮膚組織中固態的水分回融再結晶對組織產生冰晶損傷，組織中大部分游離水升華后轉冷阱上方凍干，此時溫度稍高可以進一步除去組織內部水分。

(2)吹干  皮膚組織在37℃、800mmol/L海藻糖培養液中孵育7h加載海藻糖，負載了海藻糖的皮膚用濾紙拭去表面殘留液體，表皮朝下平展于玻璃培養皿中，培養皿敞口置于生物安全柜（打開送風開關）吹干。大鼠皮膚的吹干時間設置為20～30h可以將皮膚中水分去除，玻璃化狀態良好。

經檢測得知，剛凍干皮膚活性比剛吹干皮膚活性高1/3，保存時間延長到28d，凍干組皮膚活性與剛吹干組相當。凍干過程中，皮膚組織內水分先在DMSO保護下逐漸凍結，放入凍干機后固態水升華，由于海藻糖取代水分子的作用，干燥過程組織形態結構和活性不會發生變化，但在吹干過程中皮膚組織內水分由液態直接蒸發，原來包繞在細胞外的水膜以及和蛋白質等生物大分子結合的水分子可能還未被海藻糖取代就已蒸發。上述原因可能導致未保存的凍干皮膚活性高于吹干皮膚。干燥保存的皮膚活性開始降低速率較快，降到一定程度后降低速率減慢，所以保存一周后凍干組和吹干組皮膚活性沒有統計學差異。

干燥保存的皮膚置于飽和濕度的恒溫培養箱37℃預水化15min后，皮膚依次用含800mmol/L和400mmol/L海藻糖的DMEM培養液室溫下孵育15min，用不含海藻糖的無血清DMEM培養液漂洗3次以上，清除皮膚組織中殘留的DMSO和海藻糖，最后轉入無海藻糖的DMEM培養液中孵育2h，進行形態觀察。如圖5-10所示。

凍干皮膚玻璃化狀態良好，呈半透明狀。復水后能夠恢復到新鮮皮膚的大小和色澤。凍干皮膚角質層局部受損，而組織結構和細胞形態與新鮮皮膚組織沒有差異。將凍干后復水的皮膚移植回自體大鼠，可存活13d。

自體移植后凍干組皮膚存活時間較吹干組長，可能是由于吹干過程對皮膚組織產生的損傷較大。凍干組皮膚在6d皮下出現血紅色區域可能是自體動物在移植皮下發生血管化，但后來有兩處變成暗紅色，而其他區域血紅色減弱消失可能是血管化失敗，而吹干組未出現血紅色，可能根本就沒有發生血管化。

通過HE染色和透射電鏡對比分析新鮮皮膚和干燥皮膚組織結構和細胞結構。HE染色結果顯示干燥保存過程沒有明顯改變皮膚組織結構，也未影響皮膚組織的結構完整性。透射電鏡結果說明干燥皮膚具有與新鮮皮膚無差別的細胞結構和胞外膠原結構，同時可觀察到干燥皮膚細胞中結構正常的線粒體和平滑的核膜等細胞器。結構學觀察結果證明干燥保存未對皮膚組織結構和細胞結構產生明顯影響。

通過熒光標記和MTT活性分析研究干燥過程對皮膚活性影響。熒光標記結果表明，除毛囊處明顯受損外凍干皮膚組織大部分區域在水化后能恢復活性。MTT活性分析結果顯示凍干和吹干皮膚仍能分別保持58%和48%的活性。